Trascrittoma sequenziamento che identifica l'impatto di Rare non codificanti varianti

Crescita recente e rapida popolazione umana ha portato al un accesso di varianti genetiche rare che si prevede di contribuire al fardello genetico di un individuo dal rischio di malattia. Ad oggi, gran parte del fuoco è stato sulle varianti codificanti proteine rare, per le quali l'impatto potenziale puo' essere stimata dal codice genetico, ma determinare l'impatto delle varianti non codificanti rare è stato piu' impegnativo. Per migliorare la nostra comprensione di tali varianti, abbiamo combinato i dati di sequenziamento del genoma RNA e di sequenziamento di alta qualita' da un 17-individuale, famiglia di tre generatori per contrastare espressione loci di carattere quantitativo ( eQTLs) e splicing carattere quantitativo loci ( sQTLs) all'inaterno di questa famiglia di eQTLs e sQTLs all'interno di un campione di popolazione. Utilizzando questo progetto, a mio avviso, abbiamo scoperto che eQTLs e sQTLs con grandi effetti in famiglia sono stati arricchiti con rare varianti di regolamentazione e di splicing con frequenza dell'allele minore < 0,01. Essi sono stati anche maggiori probabilita' di influenzare i geni essenziali ed i geni coinvolti nelle malattie complesse. Inoltre, abbiamo testato la capacita' dei diversi non codificante l'annotazione di prevedere l'impatto di varianti non codificanti rare. Abbiamo scoperto che la distanza al sito di inizio della trascrizione, vincolo evolutivo, e l'annotazione epigenetica erano notevolmente piu' informativa per prevedere l'impatto di varianti rare che per prevedere l'impatto di varianti comuni. Questi risultati evidenziano che le varianti non codificanti rare sono contributori importanti a singoli profili di espressione genetica e dimostrano inoltre una capacita' significativa per l'annotazione genomica per prevedere l'impatto delle varianti non codificanti rare.

Cronotropica e le risposte dromotropo a microiniezioni localizzate di glutammato nel nucleo ratto ambiguus ☆ Astratto Gli effetti cardioinibitoria di motoneuroni vagali cardiaci (CVMS) sono mediati dall'attivazione dei neuroni postgangliari nei gangli epicardico che hanno dimostrato di esercitare effetti funzionalmente selettivi sulla frequenza cardiaca e la conduzione atrioventricolare nel ratto. Qui si indaga se CVMs producono queste risposte possono occupare diverse posizioni rostrocaudale all'interno del nucleo ambiguo. Eccitazione CVMs stata tentata da microiniezioni di glutammato nel nucleo ambiguo di una preparazione arteriosa perfuso in una griglia estendentesi nel piano rostrocaudale superiore a 2 mm usando l'obex come punto di riferimento. Microiniezioni sono stati abbinati, quella fatta durante la stimolazione per misurare i cambiamenti della conduzione atrio-ventricolare (intervallo PR) indipendenti di cambiamenti nella frequenza cardiaca e l'altro in cerca di cambiamenti nel periodo del cuore (intervallo PP) non-ritmo. Sebbene evidenza di una distribuzione differenziale è stato trovato in 7 casi, nella maggior parte (13/20), siti che producono effetti massimi su entrambe le variabili coincidevano. Variazioni massime di conduzione atrioventricolare il risultato di più siti rostrale in 6 casi e da un sito più caudale in uno solo. Nel complesso, il rapporto tra la variazione di conduzione atrioventricolare alla variazione della frequenza cardiaca per un dato sito era significativamente maggiore 1 millimetro rostrale dell'obex rispetto alle due estremità della griglia di test. Concludiamo che mentre CVMs controllo della conduzione atrioventricolare sono distribuiti con un picco alquanto rostrale a quelli controllo della frequenza cardiaca in un numero di animali, vi è una sovrapposizione significativa e molto maggiore variabilità in questa distribuzione nel ratto che nei gatti e cani. Abbreviazione CVM , cardiaco motoneuroni vagale Parole Chiave Sistema nervoso autonomo ;Nervo vago ;Ambiguus Nucleo ;La frequenza cardiaca ;Il glutammato 1. Introduzione Il vago porta la alimentazione del motore parasimpatico al cuore dove esercita un'azione prevalentemente inibitorio. Aumento cardiaco vagale comporta così una caduta non solo nella frequenza cardiaca (effetto cronotropo negativo) ma anche nella velocità di propagazione del potenziale d'azione cardiaco (dromotropo negativo) e della forza di contrazione del miocardio (effetto inotropo negativo) ( vedi Jones (2001) ). Percorso motore vagale comprende un componente pregangliare, originari nel midollo allungato, che a sua volta sinapsi con un componente postganglionic all'interno dei gangli cardiaca che si trovano prevalentemente nell'epicardio atriale. Anche se gli studi tracciamento degli assoni hanno dimostrato che mammiferi motoneuroni pregangliari del vago cardiaco (CVMS) nascono dal nucleo ambiguo, dorsale vagale motore nucleo e la formazione reticolare intermedia, il nucleo ambiguo rappresenta il principale sito di origine del myelinated cardioinibitoria B-fibre ( McAllen e Spyer , 1976 , McAllen e Spyer, 1978 e Nosaka et al., 1979 ), mentre il nucleo dorsale vagale motore dà origine a fibre C amieliniche che hanno un minore effetto sul cuore e piccolo ingresso dimostrabile dai barocettori ( Ford e McWilliam, 1986 , Ford et al. 1990 , Jones et al. 1995 , Jones et al. 1998 e Nosaka et al. 1982 ). Precedenti studi da questo laboratorio hanno dimostrato che è possibile produrre eccitazione di discreta gangli epicardico con effetti selettivi sul cuore di ratto ( Sampaio et al. 2003 ). Questi dati sono coerenti con l'esistenza di gangli funzionalmente selettiva che sono stati dimostrati in altre specie ( Ardell e Randall 1986 , Gatti et al. 1995 , Gatti et al. 1997 , Randall et al., 1986a e Randall et al. , 1986b ). Nel gatto, gli assoni pregangliari vagali esecuzione dal nucleo ambiguo al cuore sembrano indirizzare specifiche cluster gangliari e quindi possono essere funzionalmente definiti a livello pregangliare ( Gatti et al. 1996 e Massari et al. 1995 ). Che CVMs pregangliari del ambiguus ratto nucleo possono essere funzionalmente specifico suggerito dai risultati di studi preliminari di tracciamento condotti in questo laboratorio. Singole microiniezioni discrete di traccianti anterograda che etichetta un piccolo numero di vagale motoneuroni pregangliari nei ambiguus nucleo determinano una distribuzione limitata di terminali degli assoni etichettati nei gangli cardiaco ( Jones et al., 1999 ). Mentre la mappatura precisa dei siti di iniezione a gangli anatomicamente identificato non è stato eseguito in questo studio, gli assoni etichettati sono stati rintracciati in esecuzione attraverso plessi ganglionated senza alcun contatto sinaptico apparente fino a raggiungere una zona di destinazione apparente dove si è verificato densa innervazione delle cellule gangliari vicine. Ciò suggerisce che singoli CVMs pregangliari possono preferenzialmente cellule gangliari innervano sporgente a un bersaglio particolare anziché più siti all'interno del cuore. L'esistenza di un tale di targeting è supportato da anterograda tracciando esperimenti che hanno dimostrato che CVMs dai lati destro e sinistro del tronco cerebrale sembrano per innervare diverse suddivisioni all'interno dei plessi gangliari cardiaci ( Cheng et al., 2004 ). Nello studio di Gatti et al. (1996) , siti nel nucleo ambiguo produrre effetti negativi dromotropo al glutammato tendevano ad essere situato rostrale a quelle che producono effetti negativi cronotropi. In alcune località rostrale, sono stati segnalati i siti che producono risposte dromotropo senza effetti sulla frequenza cardiaca. Gli attuali esperimenti esaminare se gli effetti cardiaci differenziali possono essere provocato dall'applicazione focale di glutammato lungo l'estensione rostrocaudale del nucleo ratto ambiguus mentre il monitoraggio degli effetti sulla frequenza cardiaca e la conduzione atrio-ventricolare. Un rapporto preliminare è stato pubblicato in forma astratta ( Sampaio et al., 2000 ). 2. Risultati 2.1. Effetti di microiniezioni di glutammato Microiniezioni glutammato comunemente suscitato variazioni della frequenza cardiaca e la conduzione atrioventricolare quando la punta dell'elettrodo era tra 1,5 e 1,8 mm lateralmente alla linea mediana e ad una profondità di 1,6-1,9 mm a seconda del livello rostrocaudale rispetto al OBEX. Un esempio rappresentativo dell'andamento nel tempo e l'entità delle variazioni intervalli PP e PR a diversi livelli rostrocaudale è illustrato in fig. 1 . Immagine full-size (83 K) Fig. 1. Esempi di Spike2 tracce che mostra i cambiamenti in intervalli PP e PR seguenti microiniezioni di glutammato a 5 livelli di diritto nucleo ambiguo in una preparazione. Le registrazioni di intervalli PR sono stati eseguiti durante la stimolazione cardiaca. Si noti che variazioni della frequenza cardiaca (intervallo PP) avevano relativamente poco effetto sulla pressione di perfusione che si è sostanzialmente determinata dal grado portata regolata dalla pompa di perfusione meno il flusso attraverso il circuito di bypass. La pressione del polso sorge tramite l'aggiunta di perfusato del contenuto del ventricolo sinistro, il riempimento delle quali non è stato controllato per questi esperimenti ovvero nessun tentativo è stato fatto per eliminare ritorno da vene polmonari. C'era un relativamente piccolo effetto sulla pressione del polso presumibilmente attribuibile ad una maggiore riempimento diastolico e quindi una maggiore espulsione attraverso il meccanismo di Frank-Starling. Opzioni di Figura Risposte tipicamente verificati con una latenza di insorgenza inferiore a 5 s, hanno alzato un po '5-30 s più tardi e sono ritornati ai livelli basali entro 1-2 min. Le risposte sono state riproducibili all'interno di qualsiasi serie di iniezioni e non poteva essere suscitato dalle iniezioni di volumi equivalenti di veicolo (soluzione al 20 di nL Ringer). Le dimensioni delle risposte alquanto differenziate però da una preparazione all'altra. Siti che producono risposte massime erano ben localizzate-; microiniezioni 0,5-1,0 mm mediale o laterale a questi siti erano generalmente inefficaci o prodotto relativamente piccole risposte al più latenze esordio. Aumenti significativi sia PP e l'intervallo PR sono stati osservati microiniezione di glutammato a tutti i livelli del nucleo ambiguo studiata rispetto ai livelli pre-iniezione ( Tabella 1 ). Tabella 1. Baseline e le risposte massimi a iniezione glutammato nel nucleo ambiguo ai livelli indicati. La Livello di iniezione -0.5 ( n = 13) 0 ( n = 19) +0.5 ( n = 10) +1.0 ( n = 19) +1.5 ( n = 16) PP pre-iniezione (ms) 232 ± 5.6 232 ± 6.0 207 ± 4.5 228 ± 5.4 236 ± 6.1 PP post-iniezione (ms) 244 ± 6.8 ⁎ 289 ± 12 ⁎ ⁎ 267 ± 14 ⁎ ⁎ 268 ± 10 ⁎ ⁎ 247 ± 6.1 ⁎ ⁎ B Livello di iniezione -0.5 ( n = 12) 0 ( n = 19) +0.5 ( n = 10) +1.0 ( n = 19) +1.5 ( n = 16) Pre-iniezione PR (ms) 76 ± 3.9 76 ± 3.0 78 ± 4.8 78 ± 3.4 74 ± 3.1 Post-iniezione PR (ms) 77 ± 3.8 ⁎ 83 ± 3,5 ⁎ ⁎ 84 ± 5.4 ⁎ ⁎ 87 ± 4,5 ⁎ ⁎ 76 ± 3.1 ⁎ I valori rappresentano la media ± SEM. Per il livello di iniezione, 0 rappresenta il livello di dell'obex con + essendo rostrale e - essendo caudale rispetto al OBEX. Si noti che la disponibilità di dati appaiati ha permesso la rilevazione di differenze significative nonostante le dimensioni relativamente ridotte delle risposte e l'elevata variabilità indicato dalle SEM. ⁎ ⁎ p <0.01. ⁎ p <0.05 significativamente diverso dal controllo utilizzando un accoppiato t-test, a due code. Opzioni di tabella 2.2. Distribuzione rostrocaudale Per ogni livello di iniezione la variazione complessiva intervallo PP (unpaced) è illustrato nella fig. 2 A. Confrontando l'efficacia di diversi siti nel suscitare cambiamenti nell'intervallo dell'intervallo PP si può osservare che la microiniezione di glutammato a 0, +0,5 e +1 indotta significativamente maggiori variazioni di intervallo PP rispetto agli altri due siti. Modifiche dell'intervallo PR però ( Fig. 2 B) sono stati osservati essere significativamente più solo a livello 0 e +1.0 rispetto ai cambiamenti suscitato al massimo rostrale e la maggior parte dei siti caudale. Per confrontare l'efficacia relativa di microiniezioni sulle risposte cronotropi e dromotropo, il rapporto tra la variazione di intervallo PP alla variazione dell'intervallo PR (ΔPR / ΔPP) è stato calcolato per tutti i siti in cui sono state effettuate misurazioni sia (cioè microiniezioni sia durante unpaced e il ritmo corre). L'intenzione era quella di evitare la perdita di dati importanti accoppiati che altrimenti verificarsi quando i dati sono stati riuniti. Se i CVMs controllo intervallo PP e quelli che controllano l'intervallo PR sono stati mescolati in modo omogeneo in tutta l'estensione rostrocaudale del nucleo, allora uno non si aspetterebbe di trovare picchi in questo rapporto in una particolare località rostrocaudale. Immagine full-size (31 K) Fig. 2. Le variazioni di intervallo PP (A), l'intervallo PR (B) e ΔPR / ΔPP (C) seguente microiniezioni di glutammato a 5 livelli della NA. In (A), ⁎ ⁎ p <0.01 indica differenze statisticamente significative rispetto al livello -0.5 e +1.5 e # p <0,05 indica una differenza statisticamente significativa rispetto al livello +1.0. In (B), ⁎ ⁎ p <0.01 e ⁎ p <0.05 indicano differenze statisticamente significative rispetto a -0.5 e +1.5 livelli. In (C), # p <0,05 e ⁎ p <0.01 indicano differenze statisticamente significative rispetto ai -0.5 e +1.5 livelli, rispettivamente. La distribuzione dei siti che interessano l'intervallo PP (battito cardiaco) è unimodale, con un picco tra dell'obex e 0,5 millimetri rostrale (A). La distribuzione dei siti incidono intervallo PR sono più asimmetrica nella direzione rostrale con la più grande picco a 1 millimetro rostrale OBEX (B). Il portale di produrre il massimo cambiamento intervallo PR per unità di variazione di intervallo PP è a 1 millimetro rostrale OBEX (C). Opzioni di Figura Nel caso in cui, ΔPR / ΔPP ha alzato a 1 millimetro rostrale a OBEX che ha raggiunto significatività rispetto al -0.5 e +1.5, ma non a 0 e +0,5 ( Fig. 2 C). La distribuzione dei picchi in questi istogrammi è inclinato nella direzione caudale in A rispetto a B e C suggerendo una maggiore preponderanza di cronotropi CVMs a caudale rispetto a siti rostrale. La tendenza per i siti più rostrale per avere un effetto maggiore sulla PR che su PP risulta anche dalle posizioni relative dei siti più efficace in una serie di microiniezioni unilaterali in formulazioni separate: la maggior parte (13/20) ha mostrato variazioni di picco sia PP e PR intervallo seguenti iniezioni allo stesso livello (vedi esempio in fig. 3 A). Tuttavia, in 6/20, i cambiamenti di punta in PR sono stati suscitato da siti rostrale a quelli scatenanti cambiamenti di punta in PP (vedi esempio in fig. 3 B) e solo 1 è stato il contrario trovata. Al 9 siti in 8 preparati blocco di conduzione atrioventricolare è stata osservata dopo microiniezioni glutammato tra dell'obex e 1 mm rostrale a OBEX, ma non al di sotto (vedi esempio in fig. 4 B). 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